SINGLE ARTICLE VIEW

Παρουσίαση διατριβής - Νικολοπούλου Μ.

Θέμα: "Βιοαποδόμηση πετρελαιοειδών σε θαλάσσιο περιβάλλον-Χαρακτηρισμός σχηματισμού βιοστιβάδας σε σταγονίδια υδρογονανθράκων."

 Παρουσίαση: 30/08/2013 αίθουσα Μ5.002 ώρα 13.00, Πολυτεχνειούπολη.

Εξεταστική επιτροπή:

Καθηγητής Νικόλαος Καλογεράκης, Σχολή Μηχανικών Περιβάλλοντος, Πολυτεχνείο Κρήτης (επιβλέπων).

Αναπληρωτής Καθηγητής Νικόλαος Πασαδάκης, Σχολή Μηχανικών Ορυκτών Πόρων, Πολυτεχνείο Κρήτης.

Dr. Thomas R. Neu

Καθηγητής Ευάγγελος Γιδαράκος, Σχολή Μηχανικών Περιβάλλοντος, Πολυτεχνείο Κρήτης.

Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ελευθερία Ψυλλάκη, Σχολή Μηχανικών Περιβάλλοντος, Πολυτεχνείο Κρήτης.

Επίκουρη Καθηγήτρια Δανάη Βενιέρη, Σχολή Μηχανικών Περιβάλλοντος, Πολυτεχνείο Κρήτης.

Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Μαρίνα Πανταζίδου

Περίληψη

Οι θαλάσσιες πετρελαιοκηλίδες θεωρούνται αρκετά διαδεδομένες μετα το πιο πρόσφατο ατυχήμα του Deep Horizon στον κόλπο του Μεξικό και αποτελούν μεγάλη απειλή προς το θαλάσσιο οικοσύστημα. Οι Μεσογειακές ακτές είναι ιδαιτέρως εκτεθειμένες σε κάθε πιθανή ρύπανση από πετρελαιοειδή λογω της εκβιομηχάνισης και της αστικοποίησης των περιοχών και της μεταφοράς του πετρελαίου και των ραφιναρισμένων προϊόντων του από τα διυλιστήρια. Οι επιπτώσεις από ένα τετοιο θαλάσσιο ατύχημα σε αυτή την κλειστή θάλασσα και ιδιαιτέρως στις ελληνικές ακτές και θάλασσες που αποτελούν δημοφιλή τουριστικό προορισμό αλλά και αλιευτικό καταφύγιο πολλών ειδών μπορουν να είναι αρκετα καταστροφικές. Οι άμεσες μέθοδοι αντιμετώπισης, όπως η φυσική απομάκρυνση (π.χ., πλωτά φράγματα - μηχανική συλλογή) και τα χημικά διασκορπιστικά εφ’όσον επιτρέπεται και δύναται να χρησιμοποιηθούν κάτω από προυποθέσεις λογω της πιθανής τοξικότητάς τους, σπάνια επιτυγχάνουν τον πλήρη καθαρισμό των πετρελαιοκηλίδων.
Επομένως και εφ’όσον η επικινδυνότητα για θαλάσσιες πετρελαιοκηλίδες εξακολουθεί να υπάρχει, είναι επιτακτική ανάγκη να βρεθούν και να εξεταστούν νέοι αποτελεσματικότεροι, πιο φιλικοί περιβαλλοντικά και πιο οικονομικοί τρόποι –μέθοδοι αποκατάστασης και αντιμετώπισης ενός θαλάσσιου περιβάλλοντος ρυπασμένου με πετρελαιοειδή. Η βιοεξυγίανση μεσω της βιοενίσχυσης (προσθηκη βακτηρίων που αποδομουν το πετρέλαιο) και της βιοδιέγερσης (προσθήκη θρεπτικών N&P ή άλλων περιοριστικών παραγόντων) αποτελεί μια πολλα υποσχόμενη στρατηγική στην αντιμετώπιση πετρελαιοκηλιδων μετα την χρήση συμβατικών μεθόδων άμεσης αντιμετώπισης, ενώ συμφωνα με προσφατες τεχνολογικές εξελίξεις μπορει και να χρησιμοποιηθεί ως άμεσως τρόπος αποκατάστασης. Εντούτοις η βιοενίσχυση ως μέθοδος βιοεξυγιανσης είναι αρκετά αμφιλεγόμενη ως προς την αποτελεσματικότητα της δεδομένου ότι η προσθήκη μόνο θρεπτικών (βιοδιέγερση) είχε μεγαλύτερη επίδραση στην βιοαποδόμηση του πετρελαίου από ότι η προσθήκη μικροβιακών προιόντων που ουσιαστικά εξαρτώνται άμεσα από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Ολοένα και περισσότερες έρευνες καταδεικνύουν ότι ο καλυτερος τρόπος να ξεπεραστούν οι παραπάνω περιορισμοί είναι η αποκλειστική χρήση μικροοργανισμών αυτοχθόνων με την περιοχη που θα αποκατασταθεί (έδαφος, αμμουδιά, νερό), μια προσέγγιση που έχει προταθεί ως βιοενισχυση με αυτόχθονες μικροοργανισμούς-αυτόχθονη βιοενίσχυση (autochthonous bioaugmentation-ABA).
Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθούν πιθανές μέθοδοι που θα ενίσχυαν τον ρυθμό βιοαποδόμησης του πετρελαίου στο ρυπασμένο θαλάσσιο περιβάλλον (ανοιχτής θαλάσσης και παράκτιο) μειώνοντας έτσι τον χρόνο που απαιτείται για να αποκατασταθεί. Ως εκ τουτου εξετάστηκε η ικανότητα δυο κονσόρτσια ειτε με εγκλιματισμένους (σε συνθήκες ρυπασμένης θαλάσσης με πετρέλαιο) αυτόχθονες θαλάσσιους μικροοργανισμούς ειτε με απομονωμένους μικροοργανισμούς (ΕΛΠΕ, Αθήνα) που αποδομούν πετρελαϊκούς υδρογονάνθρακες (αυτόχθονη βιοενίσχυση - ABA) ως επιτυχής στρατηγική στην εξυγίανση ρυπασμένου θαλάσσιου περιβάλλοντος παρουσία ή μη άλλων περιοριστικών παραγόντων όπως θρεπτικά οι βιογενείς επιφανειοδραστικές ενώσεις- biosurfactants (βιοδιέγερση). Οι αποδομητές πετρελαίου προήλθαν από διαδοχικούς εμπλουτισμούς και απομονώσεις θαλάσσιων δειγμάτων νερού που συλλέχθηκαν από την περιοχή του κόλπου της Ελευσίνας κοντά στα διυλιστήρια των Ελληνικών Πετρελαίων (ΕΛΠΕ), μια περιοχη που εκτίθεται σε χρόνια ρύπανση από πετρελαιοειδή. Επιπλέον η ικανότητα των κονσόρτσια με τους ηδη προσαρμοσμένους αποδομητές πετρελαίου (ABA) αντιπαρατεθηκε με την ικανότητα των αυτόχθονων μικροοργανισμών (βιοδιέγερση) να αποδομήσουν τους πετρελαικούς υδρογονάνθρακες.
Συγκεκριμένα μελετήθηκε η επίδραση λιπόφιλων οργανικών θρεπτικών (ουρικό οξύ- uric acid, λεκιθίνη-lecithin) και ανόργανων θρεπτικών (KNO3 και K2HPO4,-NPK treatment) παρουσία ή μη βιογενών επιφανειοδραστικών ενώσεων- biosurfactants στην βιοαποδόμηση πετρελαικών υδρογονανθράκων τοσο σε περιβάλλον ανοιχτής θαλάσσης όσο και σε παράκτιο. Ενώ λοιπον η βιοξυγίανση των πετρελαιοκηλίδων στο θαλλασινό νερό (υγρή μήτρα) αντιμετωπίζεται με άμεσο τρόπο, στο παράκτιο περιβάλλον (στερεή μήτρα) προσεγγίζεται μέσω της τεχνικής αποκατάστασης ρυπασμένων εδαφών γνωστή ως «τεχνική επεξεργασίας στερεάς φάσης»-landfarming, η οποία είναι παράλληλα απλή και χαμηλού κόστους συγκρινόμενη με άλλες τεχνικές αποκατάστασης ρυπασμένων εδαφών.
Ετσι προέκυψαν 4 σειρές πειραμάτων και περιλαμβάνουν:
1. Αυτόχθονη βιοενίσχυση και/ή βιοδιέγερση σε θαλάσσιο μικρόκοσμο (π.χ. Seawater 1)
2. Αυτόχθονη βιοενίσχυση & βιοδιέγερση με κονσόρτσια απομονωμένων μικροοργανισμών που αποδομούν τους πετρελαικούς υδρογονάνθρακες σε θαλάσσιο μικρόκοσμο (π.χ. Seawater 2)
3. βιοδιέγερση σε ρυπασμένη με πετρέλαιο άμμο μέσω της τεχνικής landfarming (π.χ. Sand 1)
4. Αυτόχθονη βιοενίσχυση & βιοδιέγερση σε ρυπασμένη με πετρέλαιο άμμο μέσω της τεχνικής landfarming (π.χ. Sand 2)
Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση των παραγόντων βιοεξυγίανσης βασίζεται στο τροποποιημένο πρωτόκολλο δοκιμής της αποτελεσματικότητας των παραγόντων βιοεξυγίανσης της EPA (40 CFR Ch. I, Pt 300, App. C, 2003). Το πρωτόκολλο εξετάζει τη μικροβιακή δραστηριότητα με την Ανάλυση του πιο Πιθανού Αριθμού (Most Propable Number) και ποσοτικοποιεί την απομάκρυνση των κορεσμένων υδρογονανθράκων και των πολυαρωματικών αρωματικών υδρογονανθράκων (PAHs) με τη χρήση GC-MS. Επιπρόσθετα ο βαθμός απομάκρυνσης (ρυθμός αποδόμησης) επιλεγμένων συστατικών και από τα δυο κλάσματα των κορεσμένων (ν-αλκάνια) και των αρωματικών (PAHs) εξετάστηκε μεσω βιοχημικής κινητικής αναλυσης λαμβάνοντας υποψη τις αρχές που διέπουν βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου (Batch reactor). Ενώ η ταυτοποίηση των μικροοργανισμών που αποδομούν τους πετρελαικούς υδρογονάνθρακες, καθώς και η αποκριση και αλλαγη της δομής των κονσόρτσια που χρησιμοποιήθηκαν μεταξυ των διαφορετικών πειραμάτων αλλα και επεξεργασιών επετευχθηκε με μοριακή άναλυση (PCR, RT-PCR, pyrotag Sequencing) δειγμάτων γενετικου υλικού που ελήφθησαν από κάθε επεξεργασία.
Εχει παρατηρηθεί ότι τα βακτήρια που αποδομούν υδρογονάνθρακες παρουσιάζουν υψηλή έλξη προς τα σταγονίδια πετρελαίου καταδεικνύοντας ετσι τη βιοαποδόμηση πετρελαίου ως μια πολυπλοκη διεργασία η οποία περιλαμβάνει αλληλεπιδράσεις μεταξυ των μικροοργανισμών και του πετρελαίου, οι οποιες επηρεάζονται άμεσα απο τις επικρατούσες περιβαλλοντικές συνθήκες. Ετσι λοιπον δημιουργηθηκε ακομη μια σειρα πειραματων που στοχο ειχε τη διερεύνηση και χαρακτηρισμό των αλληλεπιδράσεων των κονσόρτσια απομονωμένων μικροοργανισμών που αποδομούν πετρελαϊκούς υδρογονάνθρακες με σταγονίδια πετρελαιου άλλα και εικοσανίου (στερεό συστατικό του πετρελαίου που χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο), καθως επισης και τη διερευνηση της πιθανότητας ανάπτυξης –παρακολούθησης βιοστιβάδας γύρω από σταγονίδια πετρελαιοειδών και χαρακτηρισμό αυτής με τη χρήση μικροσκοπίας ομοεστιακής δέσμης λέιζερ (confocal microscopy- CLSM). Επιπλεον εξετάστηκε η επίδραση των εμπορικών διασκορσπιστικών ενωσεων (Corexit, S200 και Marichem) αλλά και της βιολογικης προέλευσης επιφανειοδραστικής ένωσης-biosurfactant (ραμνολιπίδια-rhamnolipids) στο σχηματισμό βιοστιβάδας αλλα και στη γενικότερη συσχέτιση των κονσόρτσια με τα σταγονίδια πετρελαίου και εικοσανίου.
Η επεξεργασία των αποτελεσματων των χημικων και μικροβιολογικών αναλύσεων αλλα και η κινητική επεξεργασία των δεδομένων τους (ειδικός ρυθμός αποδόμησης- qs) απεκάλυψαν ότι στην πειραματική σειρά Seawater 1, στην οποία χρησιμοποιήθηκαν αυτόχθονες μικροβιακοί πληθυσμοί εγκλιματισμένοι ή μη απέδωσε πολύ καλύτερα σε σχέση με την πειραματικη σειρα Sand 1, στην οποία η αποδόμηση προερχόταν αποκλειστικά από τους αυτόχθονες (μη εγκλιματισμένους) μικροοργανισμούς και παρα το γεγονός ότι προστέθηκαν συνδυαστικά ραμνολιπίδια (rhamnolipids) και λιπόφιλα θρεπτικά, η αποκριση τους ηταν χαμηλη σχετικα με αυτην της πειραματικής σειράς Seawater 1. Η βιοδιαθεσιμότητα των πετρελαικών υδρογονανθράκων αποτελει κρίσιμη παράμετρο που επηρεάζει την αποδοτικότητα της βιοεξυγίανσης σε ρυπασμένα περιβάλλοντα και επομένως εξάγεται το συμπέρασμα ότι στην πειραματική σειρά Seawater 1 οι βιογενεις επιφανειοδραστικές ενώσεις, συγκεκριμένα τα ραμνολιπίδια (rhamnolipids), επιτάχυναν τη βιοαποδόμηση του πετρελαίου κανοντας το πιο διαθέσιμο προς τους μικροοργανισμους, όπως φάνηκε στις 2 επεξεργασίες αυτόχθονης βιοενίσχυσης ABA ULRM & NPKMR και στην επεξεργασία με βιοδιέγερση ULR της συγκεκριμένης σειράς πειραμάτων.
Απεναντίας η πειραματική σειρά Sand 2 ήταν πολύ πιο αποτελεσματική σε σχέση με την πειραματικη σειρα Seawater 2 παρολο που και στις δυο σειρές χρησιμοποιήθηκε το ίδιο κονσόρτσιο μικροοργανισμών που αποδομούν πετρελαικους υδρογονάνθρακες (Eb8). Μολοταύτα αξίζει να σημειωθεί ότι παρά το γεγονός ότι προστέθηκαν ραμνολιπίδια δεν συνδυάστηκαν με λιπόφιλα θρεπτικά στην πειραματικη σειρα Seawater 2, γεγονός το οποιο πιθανότατα συνέβαλε στην όχι και τοσο επιτυχημένη απόδοση της NPKMR επεξεργασίας της πειραματικής σειράς Seawater 2 σε σχεση με την ULRM επεξεργασία της πειραματικής σειράς Sand 2.
Η συνδυασμένη εφαρμογή ραμνολιπιδίων και λιπόφιλων θρεπτικών είναι αρκετα επωφελής σε υγρή μήτρα (θαλασσινό νερό), ωστόσο όταν γινει εφαρμογή τους σε στερεή μήτρα (άμμος) η αποδοτικότητα τους είναι μέτρια και πολλες φορές αμφισβητείται. Εν αντιθέσει τα ανόργανα θρεπτικα τα οποία εκπλένονται γρήγορα στο θαλασσινό νερο αποδίδουν πολύ καλυτερα όταν εφαρμοστούν σε αμμώδη ακτή, εξίσου αποδοτικά με το ULR (ραμνολιπίδια - λιπόφιλα θρεπτικά) συνδυασμό. Η αντιφατική συμπεριφορά των επεξεργασιών ULR (πειραματική σειρά Sand 1) και ULRM (πειραματική σειρά Sand 2) ως προς τα δύο κλάσματα (αλκανίων-αρωματικών) σε σύγκριση με τις επεξεργασίες NPK (πειραματική σειρά Sand 1) και NPKM (πειραματική σειρά Sand 2) αντιστοίχως συντείνει προς αυτό το συμπέρασμα. Παραυτα η συνολικη εικόνα της επεξεργασίας ULR δείχνει ότι η παρουσία βιογενών επιφανειοδραστικών ενώσεων συνεισέφερε στην χρησιμοποίηση των λιπόφιλων θρεπτικών αυξάνοντας τη βιοδιαθεσιμότητα τους προς τους μικροργανισμούς που βρίσκονται στην άμμο.
Οι διαφορετικές επεξεργασίες προκαλούν και διαφορετική απόκριση στη δομή της κοινότητας των αποδομητών πετελαίου. Έτσι λοιπόν αξίζει να σημειωθεί ότι παρόλο που η οικογένεια των Alcanivoracaceae κυριαρχεί στις επεξεργασίες με ανόργανα θρεπτικά της πειραματικής σειράς Seawater 1, όταν εφαρμοστούν βιογενείς επιφανειοδραστικές ενώσεις (ραμνολιπίδια -επεξεργασίες NPKMR, ULR & ULRM) η σύνθεση της βακτηριακης κοινότητας αλλάζει προς την οικογένεια των Pseudomonadaceae, η οποία είναι επίσης η επικρατέστερη στο τελευταίο στάδιο (30 ημέρες) της πειραματικής σειράς Seawater 2, ενώ στο πρώιμο στάδιο της συγκεκριμένης πειραματικής σειράς η οικογένεια των Alcanivoracaceae είναι και πάλι η επικρατέστερη. Αξίζει να σημειωθει μετα από αυτήν την παρατήρηση ότι τα είδη του Pseudomonas αντέχουν και μπορουν να μεταβολίσουν παραπροιόντα της βιοαποδόμησης ή αλλους πιο ανθεκτικούς υδρογονάνθρακες, καθιστώντας τα έτσι σημαντικούς βιοκαταλύτες οι οποιοι επιταχύνουν την βιοαποδόμηση εκει που τα άλλα ειδη σταματούν.
Η παραπανω αναλυση απεδειξε το πλεονέκτημα των μεικτών κονσόρτσια σε σχεση με κονσορσια που αποτελουνται από στελέχη ενός είδους μόνο και η παρατηρηση με μικρόσκόπιο CLSM απεκάλυψε ότι οι μικροοργανισμοί οργανώνονται σε συμπλέγματα μεταξυ τους και με τα διασκορπισμένα σταγονίδια πετρελαίου σχηματίζοντας πολύπλοκες δομές τύπου σταφυλιού και αστερία (grape style shapes- star-like patterns) οι οποίες ενώνονται μεταξύ τους με γέφυρες από βακτήρια και βιοπολυμερή όπως είναι οι εξωκυτταρικοί πολυσακχαρίτες (EPS). Η παραπάνω έρευνα έδειξε ότι ο μηχανισμός δράσης των μικροοργανισμών είναι πολύ διαφορετικός και πολυπλοκότερος από αυτόν που οι μέχρι τώρα μελέτες με συγκεκριμένα στελέχη είχαν δείξει (σχηματισμός βιοστιβαδας μεσω της οποίας αποδομούν το πετρέλαιο).
Η νεα αυτή οργάνωση και δομή που παρατηρείται μεταξύ των μεικτών κονσόρτσια και του πετρελαίου δημιουργησε μια νέα προοπτική-μηχανισμό με τον οποίο τα μικτά κονσόρτσια χρησιμοποιούν τους υδρογονάνθρακες πετρελαίου και θα μπορούσε να προσφέρει μια νέα διάσταση για τη μελέτη των μικροβιακών κονοτήτων που οργανώνονται σε συσσωματώματα και βιοστιβάδες στο θαλάσσιο οικοσύστημα. Επιπλέων η κατανόηση των βασικών μηχανισμών αλληλεπίδρασης μεταξύ μικροοργανισμών και ρυπαντή (πετρελαιοειδή) μπορει να βοηθήσει στην πρόβλεψη όχι μονο της τύχης του πετρελαίου στο περιβάλλον αλλα και να συντελεσει στην δημιουργία βελτιωμένων διασκορπιστικών ουσιών ή βιολογικης προέλευσης επιφανειοδραστικών ενώσεων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατω από διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες.
Μολοταύτα το εξαιρετικά ευαίσθητο παράκτιο περιβάλλον και η τοξικότητα του πετρελαίου που διακυμαίνεται ανάλογα με το ποσό που ελευθερώνεται στο περιβάλλον καθιστούν τις επιπτωσεις μιας πετρελαιοκηλίδας ιδιατέρως εμφανείς. Επομένως η άμεση εφαρμογή της (βιο)εξυγίανσης είναι ζωτικής σημασίας ουτως ώστε να μειωθείι η συγκέντρωση πετρελαίου κατω από το κρίσιμο όριο και με αυτόν τον τρόπο να ελαχιστοποιηθεί η όχληση του θαλάσσιου οικοσυστήματος.
Συγκεκριμένα η παραπάνω διερεύνηση απέδειξε ότι απουσία στοιχειωδών θρεπτικών, ο εμβολιασμός μονάχα με πληθυσμό αυτόχθονων μικροοργανισμών ικανών να αποδομήσουν τους πετρελαικούς υδρογονάνθρακες δεν θεωρείται επαρκής. Ωστοσο ο συνδυασμός απαραιτητων θρεπτικών ή άλλων περιοριστικών παραγόντων (π.χ. ραμνολιπίδια) μαζι με τον αυτόχθονο πληθυσμό των αποδομητών υδρογοναθράκων πλεονεκτεί με αποτέλεσμα την αυξημένη κατανάλωση των υδρογονανθράκων από τον πληθυσμό αυτόχθονων μικροοργανισμών που προστέθηκε. Ετσι λοιπον πιστεύουμε ότι ο συνδυασμός αυτόχθονης βιοενίσχυσης και βιοδιέγερσης μπορει να αποτελέσει μελλοντικη στρατηγική που θα μπορούσε να επιταχύνει την βιοαποδόμηση σε περιπτώσεις οπου υπάρχει έλλειψη θρεπτικών και μικροοργανισμών. Η τεχνική αυτή παρουσιάζει μια σειρά πλεονεκτημάτων όπως μικρότερο χρόνο επεξεργασίας, μεγαλύτερη αποδοτικότητα, μικρότερη όχληση στο περιβάλλον και τυγχάνει σχετικά εύκολα δημόσιας αποδοχής. Ετσι λοιπόν η μελλοντική έρευνα που θα καθορίσει τη φέρουσα ικανότητα των διάφορων περιβαλλόντων και των μηχανισμών που τους ελέγχουν θα μπορούσε να είναι αρκετα εποικοδομητική στην εν προκειμένω προσέγγιση.

Abstract

Oil spills are considered a widespread problem after the last accident at the Mexico Gulf that poses great threat for any ecosystem. Specifically Mediterranean coastal regions are exposed to oil pollution due to extensive industrialization and urbanization and transport of crude and refined oil to and from refineries. The impact of an oil spill in this closed sea and particularly in the Greek coastline and sea that are popular touristic destinations and shelter of many marine species can be disastrous. First response options, such as physical removal (e.g. booms, skimmers, adsorbents, etc.) and dispersants whenever applicable due to their potential toxicity rarely achieve complete cleanup of oil spills.
Nevertheless, major oil spills highlight the need for environmentally responsible and cost-effective mitigation technologies. Bioremediation through bioaugmentation (addition of oil-degrading bacteria) and/or biostimulation (addition of nutrients N&P) constitutes a promising strategy for combatting oil spills following first response actions and recent technological advances could promote bioremediation to a priority option in combating oil spills. However, bioaugmentation is one of the most controversial issues in bioremediation since nutrient addition alone has been found to have a greater effect on oil biodegradation than the addition of microbial products that are highly dependent on environmental conditions. There is increasing evidence that the best way to overcome the above barriers is to exclusively use microorganisms indigenous to the sites (soil, sand, and water) to be decontaminated, an approach termed “autochthonous bioaugmentation” (ABA).
The specific aims of the present work were to investigate possible methods to enhance the rate of biodegradation of oil in a contaminated marine environment (both seawater and shoreline). Hence we investigated the capability of either acclimated indigenous microbial consortium or hydrocarbon degraders consortium enriched from seawater samples taken from Hellenic Petroleum Refinery (Athens, Greece) a site exposed to chronic pollution with crude oil (ABA) in the presence or absence of other rate limiting factors like nutrients and biosurfactants (biostimulation) as a potential strategy for the successful remediation of polluted marine environments. In addition the effectiveness of these certain acclimated consortia (ABA) was compared to indigenous population activity (biostimulation) on the bioremediation of oil spills.
Specifically the effects of the lipophilic nutrients (uric acid and lecithin) and inorganic nutrients (KNO3, K2HPO4) with or without biosurfactants on the degradation of crude oil hydrocarbons in both seawater and sand matrix were also examined. While bioremediation in liquid matrices (seawater) is implemented in a more direct way, in the soil matrix (sand) is achieved through landfarming which is both simple and cost-effective to implement compared with other treatment technologies.
Thus the outcome approaches include 4 sets of experiments:
1. Autochthonous bioaugmentation and/or biostimulation of seawater microcosm (i.e. Seawater 1)
2. Autochthonous bioaugmentation & biostimulation with isolated hydrocarbon degraders consortium of seawater microcosm (i.e. Seawater 2)
3. Landfarming of oil polluted beach sand through biostimulation (i.e. Sand 1)
4. Landfarming of oil polluted beach sand through autochthonous bioaugmentation & biostimulation (i.e. Sand 2)
The method which has been used for the evaluation of these bioremediation methods is based on a modified bioremediation agent effectiveness testing protocol by EPA (40 CFR Ch. I, Pt 300, App. C, 2003). The protocol tests for microbial activity by Most Probable Number (MPN) determination and quantifies the disappearance of saturated hydrocarbons and polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs) by GC-MS analysis. Moreover the disappearance extent (degradation rate) of certain compounds from both saturated fraction (n-alkanes) and aromatic fraction (PAHs was also investigated through biodegradation kinetics analysis (Batch reactor). Furthermore identification of the key microorganisms in oil biodegradation community response and composition changes among different amendments was also performed through molecular analysis (PCR, RT-PCR, pyrotag Sequencing) of DNA extracts from each treatment.
Hydrocarbon degrading bacteria as shown by several studies have a high affinity to oil droplets which indicates that oil bioremediation is a complex process that involves interactions between oil and microorganisms under certain environmental conditions. Therefore in this study another set of experiments investigating and characterizing the interaction of hydrocarbon degraders consortia on oil and eicosane droplets (cellular level) by means of confocal laser scanning microscopy (CLSM) was also included. Moreover their response after the addition of certain commercial dispersants just like those that have been or could be used in the event of a real oil spill (Corexit, S200, Marichem) but also of more environmentally friendly biosurfactants (Rhamnolipids) was also examined.
Investigation through chemical, microbiological and kinetics analysis (specific degradation rate, qs) has revealed that Seawater 1 experimental set in which acclimated or not indigenous microorganisms were used performed far better than Sand 1 experimental set in which degradation was induced only by indigenous microbial populations and despite the fact that combined Rhamnolipids and lipophilic nutrients were used still microbial response was not as strong as in Seawater 1 experimental set. Bioavailability of oil hydrocarbons is the critical factor that affects the efficiency of bioremediation in oil contaminated environments and It can be concluded that in Seawater 1 experimental set biosurfactants, in particular rhamnolipids, accelerated the biodegradation of crude oil by making it more available to microorganisms as expected in the two ABA treatments (ULRM-Uric acid, Lecithin, Rhamnolipinds and preadapted indigenous Microorganisms & NPKMR- Inorganic nutrients, Rhamnolipinds and preadapted indigenous Microorganisms) and the biostimulation treatment (ULR- Uric acid, Lecithin, Rhamnolipinds).
On the other hand Sand 2 experimental set seemed more successful than Seawater 2 experimental set in which both experimental sets the same consortium (Eb8) was used. However it should be noted that despite the fact that Rhamnolipids were added lipophilic nutrients were not included in Seawater 2 experimental set, which possibly had contributed to the less successful performance of NPKMR treatment of Seawater 2 experimental set compared to ULRM treatment of Sand 2 experimental set.
Combined application of Rhamnolipids and lipophilic nutrients could be beneficial in liquid matrix (seawater), however when applied to solid matrix their performance is questioned compared to one in the liquid matrix. On the contrary inorganic nutrients usually being washed out when applied in seawater perform better when applied to sand almost equally to ULR combined performance. Inconsistent behaviour of ULR (Sand 1 experimental set) and ULRM (Sand 2 experimental set) treatments between the two oil fractions (alkanes-PAHs) compared to NPK (Sand 1 experimental set) and NPKM (Sand 2 experimental set) treatments respectively could support this conclusion. Still overall ULR treatment performance suggests that the presence of biosurfactant could possibly have contributed to utilization of lipophilic nutrients by making them more available to soil microorganisms.
Nonetheless especially in the soil matrix (sand) bioavailability of hydrophobic compounds is often the rate-limiting step in the process and the efficiency of biosurfactants or other rate limiting co-substrates mainly could be attributed to the interactions between target organic compounds, bacterial species, water content and surfactants.
Different types of amendments provoke different structures in the resulting biodegradation communities. Thus Alcanivoracaceae as investigated in the Seawater 1 experimental set was the dominant family in treatments with inorganic nutrients, when biosurfactant is applied (rhamnolipids-treatments NPKMR, ULR & ULRM) community shifts to the family of Pseudomonadaceae, which was also the dominant family at the late stage (30 days) in the Seawater 2 experimental set (treatments NPKM and NPKMR), whereas at early stage of the same experimental set Alcanivoracaceae was the dominant family as well. Regarding this observation, Pseudomonas sp. can be considered as exceptional biocatalysts utilizing either metabolic by-products or other more recalcitrant hydrocarbons and thus can accelerate bioremediation when other species stop.
Thus mixed consortia are advantageous over single species consortia on hydrocarbons degradation and CLSM investigation has revealed that bacteria of mixed consortia are organized into clusters forming strings, star and grape like shapes of bacteria and fine oil droplets bridging each other with EPS. However it should be noted that contrary to what so far was proposed as potential mechanism for the interaction between oil droplets and bacteria biofilm was not the preferred interaction between the tested consortia and the oil droplets.
This new organization and structure between oil and microbial consortia has brought up a new perspective-mechanism in which mixed consortia utilize oil hydrocarbons and could provide a new dimension for the study of coaggregation and biofilm microbial communities in the marine ecosystem. Moreover understanding the interactions between oil-degrading microorganisms is essential, not only when predicting the fate of hydrocarbons in the environment but also for the development of new improved surfactants formulations or biosurfactans that can be used under different environmental conditions.
Nonetheless highly sensitive coastline environment and oil toxicity that fluctuates depending on the amount released to the environment constitute the impact of an oil spill exceptionally evident. Therefore immediate (bio)remediation is vital in order to decrease oil concentration below critical level and by that diminish marine ecosystem disturbance.
This work has demonstrated that in the absence of essential nutrients, inoculation only with autochthonous hydrocarbon degraders is not an effective treatment, however when the needed nutrients or other biostimulants are supplemented the advantages of such combination are obvious and result in accelerated hydrocarbon consumption by the added autochthonous consortium. Thus we strongly believe that the combination of autochthonous bioaugmentation and biostimulation is a promising strategy to speed up bioremediation in cases where there is lack of both nutrients and indigenous degraders. This technique has a number of advantages like shorter treatment time, greater potential efficiency, lower impact on the environment, and relative ease in obtaining public support. Thus future research that would define the carrying capacities of various environments and the mechanisms that control them could be fruitful in this regard.

Παρουσίαση Διατριβής

Μπορείτε να παρακολουθήσετε την παρουσίαση της διατριβής από το παρακάτω βίντεο.

 

<iframe width="560" height="315" src="https://www.youtube.com/embed/bgogpPKka9o" frameborder="0" allowfullscreen=""></iframe>

 

Αρχεία

Κείμενο  διδακτορικής διατριβής (Ιδρυματικό Αποθετήριο Πολυτεχνείου Κρήτης)

Παρουσίαση διδακτορικής διατριβής (pdf)